Целью данного исследования является выявление вирозов, диагностика их возбудителей – вирусов – молекулярно-генетическими методами, уточнение визуальных симптомов проявления данных заболеваний на виноградных насаждениях Крыма.

Вирусы, вызывающие заболевания виноградной лозы, в основном имеют одноцепочечные РНКгеномы. В последние годы также были обнаружены патогенные вирусы виноградной лозы с ДНК-геномами. Согласно стандарту ЕРРО в перечне патогенов, обязательных для тестирования в саженцах винограда, наиболее опасные вирусы сгруппированы по типу поражения и уровню вредоносности: А – вирусы, вызывающие дегенерацию винограда; В – вирусы, вызывающие скручивание листьев; С – вирусы, вызывающие деформацию древесины; D – вирусы, вызывающие пятнистости винограда. Недавно в США и Канаде обнаружен новый патоген – вирус красного виноградного пятна Grapevine redblotch virus (GRBV). Другой относительно новый патоген – вирус Пино гри Grapevine Рinot gris virus (GPGV), был идентифицирован на винограде с симптомами хлороза и деформации листьев, после чего зарегистрирован во всем мире, особенно в странах Европы, Азии, Южной и Северной Америки (Канада, Онтарио и Британская Колумбия).

Согласно Xiao et al. (2018) понимание типа вирусов, их распространения и тяжести вирусных заболеваний является первым шагом к правильному подходу в контроле исследуемых инфекций. Экономическое влияние вирусов виноградной лозы на производство винограда в России мало изучено. Такие исследования проводились в небольшой части коммерческих виноградников. При этом фитосанитарному обследованию должны подлежать максимально возможные площади ампелоценозов. Актуальность настоящего исследования заключается в проведении следований молекулярно-генетическими методами с целью выявления вирусных инфекций и их видового разнообразия на промышленных виноградниках Крыма. Настоящая работа включает в себя диагностику на вирусы, ранее не анализируемые в Российской Федерации.
Выбранные для изучения в настоящем исследовании виды инфекций могут представлять угрозу стабильному развитию виноградарства Крыма в связи с их агрессивностью и распространенностью в странах Европы, которые являются основными поставщиками посадочного материала в Россию.

Материалы и методы.
Исследования проводились в 2020-2021 гг. В качестве материала отбирали листья и побеги виноградного куста. Образцы собирали по визуальному проявлению симптомов. Отбор происходил в период вегетации 2020 г. на виноградниках Республики Крым, в трёх его зонах (Южнобережная зона, Юго-западная, Центральная степная). Лабораторные исследования по диагностике вирусов проводились в Испытательном лабораторном центре ФГБУ «ВНИИКР».

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовался для обнаружения ДНК-вирусов виноградной лозы. Чтобы обнаружить РНК-вирусы в растении, ПЦР проводился на комплементарной матрице ДНК (кДНК), которая является результатом реакции обратной транскрипции на экстрагированной растительной РНК. ПЦР и ОТ-ПЦР часто используются в исследованиях вирусного генетического разнообразия.

Чтобы получить исчерпывающую картину распространения наиболее значимых вирусов на промышленных виноградниках Крыма, сначала отбирали образцы в разных зонах возделывания винограда Крыма, а затем проводили OT-ПЦР с последующим гель-электрофорезом. Результаты подтверждали методом секвенирования.

В связи с тем, что вирусы зачастую имеют нескольких штаммов, важно использовать праймеры (табл. 1), которые могут обнаружить все штаммы каждого из целевых вирусов, таких как: GLRaV-3, GPGV, GFLV, GVB, GFkV.

Изолирование вирусов из тканей растений осуществляли с помощью разрушающего Grinding буфера, а экстрагирование РНК с помощью CTAB-буфера по методике «Doyle & Doyle» в модификации Матяшовой и др.. После положительных результатов, полученных на электрофореграммах, проводили очистку продуктов ПЦР набором «Cleanup Standard» (ЗАО «Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. Секвенирование проводили по методологии Сэнгера на генетическом анализаторе АВ-3500 («Applied biosystems», США, Япония) согласно модификации Белкина.

Обсуждение результатов Настоящее исследование было нацелено на молекулярную диагностику вирусов винограда. Исходя из проанализированных данных разных источников известно, что из-за вирусных инфекций виноградники могут терять от 20 до 80 % урожая, что может вызвать серьёзный дефицит сырья на рынке и колоссальные убытки в виноградарстве.

Исследуемые образцы виноградной лозы проверялись на 5 самых опасных и экономически значимых вирусов, которые могут привести к снижению продуктивности виноградных насаждений: GFLV – Grapevine fanleaf virus, GFkV – Grapevine fl eck virus, GLRaV-3 – Grapevine leafr ollassociated virus 3, GPGV – Grapevine Pinot gris virus, GVB –Grapevine virus B (табл. 2).

В табл. 2 представлено уточненное описание визуальных симптомов проявления вирозов на виноградниках, подтвержденное результатами молекулярногенетических исследований.

В процессе осмотра виноградников выявляли симптомный материал (хлорозы, некрозы, скручивание, мелколистность и др., рис. 1). В случае отсутствия симптомов также производили частичный отбор, так как вирусные инфекции могут присутствовать в латентном состоянии. В общей сложности собрано 153 образца побегов с листьями, в 4 виноградарских районах Крыма. В 30 из них вирозы подтвердились, причем в некоторых образцах было диагностировано по 2 вируса. Исследование проводили методом ОТ-ПЦР с последующим секвениванием.

Результаты гель-электрофореза продуктов ПЦР показали, что на виноградниках Южнобережного (ЮБК), Юго-западного (ЮЗК) и Центрального степного (ЦСК) Крыма присутствуют четыре вирусных инфекции из пяти исследуемых: GLRaV-3, GPGV, GFLV, GFkV.

Вирус опробковения коры винограда Grapevine virus B (GVB) не был обнаружен ни в одном из 153 образцов. Вирус скручивания листьев (GLRaV-3) был зафиксирован на виноградниках ЮБК и ЦСК на следующих сортах винограда: Каберне-Совиньон, Мускат белый, Мускат Оттонель. Как видно из результатов электрофореза (рис. 2), в 7 образцах выявили фрагмент искомой длины (301 п.н.о.) согласно авторам праймерной системы вируса скручивания листьев винограда, серотип 3 Grapevine leafr oll-associated virus 3 (GLRaV-3).

Полученные в результате нуклеотидные последовательности имели идентичность с данными NCBI от 96 до 99%.
В дальнейшем после тщательной подготовки планируется депонирование расшифрованных последовательностей
в международные базы данных. На фотографии отчетливо видны симптомы вирусной инфекции GLRaV-3 – хлорозы мезжилковой части листовой пластины, угнетение лозы и некрозы (рис. 3).

Вирус Пино гри Grapevine Pinot gris virus (GPGV) был выявлен на виноградниках сорта Каберне-Совиньон в Южнобережной и Центральной степной зонах Крыма. Проявление инфекций отчетливо видно на рис. 4. Основные симптомы – мелколистность и хлоротичность листьев наблюдали во многих точках отбора материала.

При этом такие нарушения развития могут быть связаны с минеральным голоданием и сильной обработкой пестицидами (гербицидами), что подчеркивает необходимость подтверждения симптоматики лабораторными методами диагностики.
Результаты проверки на вирус короткоузлия винограда Grapevine fanleaf virus (GFLV) выявили следующие места заражения и сортовую принадлежность: Каберне-Совиньон в условиях Южнобережной зоны; Бастардо магарачский – Центральной степной. Результаты электрофореза в образцах выявили фрагмент искомой длины (558 п.н.о.) согласно авторам праймерной системы.

Проверка на вирус мраморности винограда Grapevine fl eck virus (GFkV) показала самое массовое поражение вирусной инфекцией в трех виноградарских зонах сбора образцов (Южнобережной, Центральной степной и Юго-западной) и большее разнообразие в сортовой принадлежности: Каберне-Совиньон, Мускат белый, Мускат Оттонель, Бастардо магарачский, Ркацители.

Следует отметить, что основные очаги заражения вирусами – это старые виноградники, возраст которых составляет 30-40 лет, что говорит о возможном ввозе инфекций вместе с посадочным материалом, не проанализированным в достаточной мере из-за отсутствия методологии и диагностических тестов в России в 80-90-е гг.

Выводы

По результатам анализов методом ПЦР и секвенирования доказано, что на виноградниках Крыма присутствуют четыре вида экономически опасных вирусных инфекций из пяти исследуемых: вирус скручивания листьев винограда, серотип 3 Grapevine leafr ollassociated virus 3 (GLRaV-3), вирус Пино гри винограда Grapevine Pinot gris virus (GPGV), вирус коротузлия винограда Grapevine fanleaf virus (GFLV), вирус мраморности винограда Grapevine fl eck virus (GFkV).

Определено, что подвержены вирозам основные сорта винограда – Каберне-Совиньон и Мускаты.

Показано, что основные очаги заражения вирусами – это старые виноградники, возраст которых составляет 30-40 лет, что говорит о возможном ввозе инфекций вместе с посадочным материалом, не проанализированным в достаточной мере из-за отсутствия методологии и диагностических тестов в России в 80- 90-е гг.

Исследования по выявлению вирозов на виноградных насаждениях Крыма и диагностика их возбудителей – вирусов – позволят достоверно определить их фитосанитарное состояние. Для принятия решений о фитосанитарном статусе вирусных болезней винограда для территории России и стран Евразийского экономического союза необходимы результаты полевых исследований и диагностика фитопатогенов молекулярно-генетическими методами, представленными в настоящей работе.

Источник:
Бондаренко Г.Н., Ермолов В.Ю., Алейникова Н.В., Корнилаева О.Н. Выявление вирусных инфекций винограда в Республике Крым // «Магарач». Виноградарство и виноделие, 2022; 24(1):48-54. DOI 10.35547/IM.2022.13.77.008

У нас можно купить автономную метеостанцию, датчик ультрафиолета, датчик уровня осадков, датчик влажности и температуры почвы с доставкой по республике Крым, Краснодарскому краю, Ростовской области, Ставрополью ,Дагестану и Северной Осетии.